В 480 г. до н. э. армия персидского царя Ксеркса (Родриго Санторо) начала вторжение в Грецию. Спартанский царь Леонид (Джерард Батлер) возглавил объединённое войско греческих городов и преградил персам путь в Фермопильском ущелье. Греки отражали попытки многократно превосходящей их числом персидской армии прорваться через Фермопилы до тех пор, пока персы не нашли предателя, который провёл их через горы в обход ущелья. Узнав об этом, Леонид приказал союзным отрядам отступить, а сам остался с тремя сотнями спартанцев защищать проход.

Фильм снимался с использованием технологии «цифровой подкладки», при котрой все сцены снимаются на фоне «синего экрана», а затем в кадр методом цифровой обработки добавляются фон и необходимые декорации. По этой же технологии снимался фильм «Город грехов» (с одним отличием: «Город грехов» сразу снимался цифровыми камерами высокого разрешения, а «300» — на классическую плёнку и лишь затем оцифровывался).